W poł. XVI w. liczni przedstawiciele możnych rodów, m.in. Radziwiłłów, Hlebowiczów, Kiszków, Sapiehów, Szemetów, przeszli na kalwinizm, rozwijało się piśmiennictwo rel. związane z reformacją. Pierwszy zbór kalwiński w Wilnie wzniesiono 1555, kolejne powstały w Birżach, Kiejdanach, Kownie i Szakach. W 1591 istniało 189 zborów kalwińskich na terenie Wielkiego Księstwa Litew., w tym 110 na obszarze rdzennej L. W tym czasie doszło do waśni rel. między katolikami i protestantami oraz prawosławnymi i unitami (unia brzeska 1596). Spadek znaczenia kalwinizmu nastąpił w poł. XVII w., wraz ze śmiercią wielkiego hetmana litew. Janusza Radziwiłła (1655). Po zawarciu unii brzeskiej Wilno stało się siedzibą metropolity unickiego. Od 2. poł. XVI w. w Wilnie istniała największa na L. wspólnota żyd., zw. Jerozolimą Północy; działał tu m.in. rabin Eliasz ben Salomon Zalman, funkcjonowały liczne drukarnie hebrajskie.